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　　蛋白质-聚合物偶联物因其高特异性、低脱靶性等优点在作为疾病治疗剂中发挥着举足轻重的作用

　　蛋白质-聚合物偶联物被广泛用作疾病治疗剂，具有较高的靶点特异性等优点，但其使用也面临着一些挑战：快速清除和低物理稳定性。目前FDA 批准的蛋白质偶联物均与聚(乙二醇)(PEG)共价连接。这些聚乙二醇化药物在血液中的半衰期更长，给药频率降低，这对患者来说是一个显着的优势。然而，PEG 有一些潜在的缺点需要替代品的开发，因此开发具有增强的药代动力学特性及其他优势（例如改进的稳定性或可降解性）的聚合物对于推进蛋白质治疗领域非常重要。

　　1977 年，Abuchowski 及其同事利用三聚氯氰偶联剂首次证明了单甲氧基-PEG (mPEG)与牛血清白蛋白(BSA)的结合；1990年FDA 批准了世界上首个聚乙二醇修饰药物 Adagen；1995年和1998年又相继发展了ATRP和RAFT活性聚合；2002年FDA批准了美国安进公司研发的PEG-G-CSF注射液“Neulasta”上市（图1）。

　　总之蛋白质-聚合物偶联物因其高特异性、低脱靶性等优点在作为疾病治疗剂中发挥着举足轻重的作用，但蛋白质通过新陈代谢、排泄和其他途径在体内迅速清除或失活，增强蛋白质特性（例如药代动力学）的方法主要有两种：一是使用重组 DNA 技术替换氨基酸或创建融合蛋白；另外是合成聚合物的偶联物，其中最常见的例子是聚乙二醇（PEG）。然而合成蛋白质-聚合物偶联物并不总是那么简单，需要仔细考虑多种因素：聚合物的选择、蛋白质靶点的选择、偶联化学的选择以及体外和体内共轭的表征。

　　目前最广泛使用的聚合物是PEG，它不仅增加了结合蛋白的流体动力学半径，还有助于免疫原性蛋白逃避免疫系统。PEG基团具有生物相容性，可商购获得。然而，一些人已被证明会产生抗 PEG 抗体，因此这些患者体内的PEG 化蛋白可以更快地清除。例如，40%接受 PEG 化尿酸酶治疗的患者产生了抗 PEG 抗体，并且抗体水平与治疗开始后 6 周左右发生的药物疗效丧失紧密关联[1]。PEG 刷状聚合物不但可以增强循环半衰期，也不会诱导抗 PEG 抗体反应。例如：聚（聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯）—p（PEGMA）是一种具有低聚乙二醇侧链的甲基丙烯酸酯聚合物，已用于多种蛋白质-聚合物偶联物。此外，带有PEG侧链的降冰片烯聚合物能够更好的降低病毒衣壳颗粒的免疫原性，而聚( N- (2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(p(HPMA))是另一种水溶性和生物相容性聚合物，可用于增加体内半衰期，也没有相关的免疫原性。

　　一般来说，与小分子偶联反应相比，聚合物与蛋白质的偶联面临着更多的空间和熵屏障。因此，常用的偶联方法需要效率很高，偶联化学的选择还需要仔细考虑位点选择性、蛋白质上残基的可用性。

　　位点选择性偶联对保持充足的生物活性是非常必要的，通常，缀合位点应远离活性位点或结合基序，以最大限度地保持蛋白质活性。赖氨酸是蛋白质表面最丰富的氨基酸，并且通常是第一个尝试进行非选择性缀合的残基，ε-氨基需要中性至碱性 pH 值才能有充足的亲核性(p Ka ~ 10.5)，赖氨酸不常用于位点选择性缀合，常常要处于暴露区域，且微环境（例如相邻赖氨酸的存在和局部电荷）会影响反应性。但一些活泼酯、还原性的胺等可以使得赖氨酸发生位点选择性偶联。Bernardes和同事发现丙烯酸磺酰酯可以选择性地修饰五种不同蛋白质中的单个赖氨酸。半胱氨酸的高亲核性使其易于修饰，但游离半胱氨酸很少见，并且通常位于疏水口袋中。如果蛋白质工程工具很容易获得，则在所需位点安装半胱氨酸的氨基酸取代是位点选择性耦合的有效策略。二硫键存在于大多数蛋白质中，它们能用来作为残基特异性结合位点。 N-末端胺的 p Ka(6-8)比赖氨酸(~10.5)显着降低，选择性N-末端修饰通常是 pH 依赖性的，N端的酶促标记也能够正常的使用来自金黄色葡萄球菌的分选酶 A(SrtA)来实现。C-末端羧酸根基团难以与侧链羧酸根(Asp/Glu)进行区分，因此能在 C-末端安装了特定的氨基酸序列，用于通过天然化学连接或酶促连接进行偶联。虽然酪氨酸的利用率较低，但它是一种具有中等表面丰度(4.8%)的氨基酸，并且已经开发了几种偶联方法，如重氮偶联、PTAD偶联等。

　　纯化蛋白质-聚合物偶联物通常来说相对困难，因为聚合物几乎总是过量使用，并且偶联效率通常低于 100%，因此混合物通常包含三种类型的大分子——蛋白质、聚合物和偶联物。对于非常小且稳定的蛋白质，能够正常的使用高效液相色谱（HPLC）进行纯化，然而有机溶剂的使用和柱内的高压会使大多数蛋白质的三级结构变性。而分子排阻色谱(SEC)仅适用于一小部分偶联物，因为它最适合分离尺寸差异高于两倍的两种物质。其他色谱方法，如离子交换和疏水相互作用色谱通常是更好的选择，它们在临床上常用于蛋白质药物的生产。

　　偶联物的常用表征方法有凝胶电泳、质谱、SEC 和动态光散射(DLS)，没有一种方法是确定性的，应该使用多种办法来进行表征。

　　偶联物的毒性和免疫学评估很重要，在开发蛋白质-聚合物偶联物作为治疗药物时应尽早进行,此外偶联物的体内生物分布对其体内生物活性有重大影响。

　　在过去几年里，用于医学的蛋白质-PEG 偶联药物取得了重大进展。目前已有多种PEG 化蛋白质药物在临床上用来医治一系列疾病。但是，仍有改进的空间，许多偶联物虽然增加了循环半衰期，但生物活性明显降低。研究表明，通过合理设计偶联位点，利用位点选择性偶联反应，可以充分保留蛋白质的活性。

　　此外，随着基因工程、高效偶联化学、以及合成用于共轭的末端功能聚合物的新方法的发展衍生了可降解的 PEG 替代品和新的仿生策略，以提高天然蛋白质的稳定性和活性。蛋白质-聚合物偶联将是一个令人兴奋的领域，需要具有不一样学科专业相关知识的科学家一起努力，相信未来科学家们科可以改进大自然高度进化的机制，以促进人类健康。